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RNA-seq方法和应用- 陈巍学基因(7)

NA-seq是高通量测序中最常见的一种应用

本期课程介绍其:
1、方法原理;
2、生物信息分析,表达差异、火山图展示、聚类分析、GO、Pathway、可变剪接、融合基因、点突变

2014-12-31 课时:26分钟

Image J应用实例

本课程主要介绍
1、条带灰度值分析(DNA/western blotting 条带的分析)
2、测量不规则图形面积(细胞面积及计数)

2015-01-14 课时:9分钟

成体干细胞基因修饰策略及应用基础研究

成体干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞等多种类型,在多种疾病的治疗的治疗中具有广阔的应用前景。但是,成体干细胞临床应用依然存在植入效率低、功能不显著等问题。干细胞治疗通过组织重建以及分泌生长因子等综合机制发挥治疗作用。利用特定功能的基因修饰有望提高成体干细胞的治疗效果。

重组腺病毒是应用最广泛的基因转移载体,但部分干细胞缺乏其受体CAR,因而其感染效率很低。另外, 腺病毒载体携带外源基因的容量有限。为提高重组腺病毒载体修饰成体干细胞的效率及治疗效果,我们进行了一下工作:
(1)重组腺病毒载体的改构: 对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,将其替换为B组11p型腺病毒(Ad11p)的纤维顶球,从而改变了它的靶向性,增强了对造血细胞的感染效率;改构腺病毒通过CD46介导而实现对血液细胞的感染;通过和甲病毒的融合,提高重组腺病毒携带外源基因的容量及表达效率;构建了外源基因非整合于基因组的重组腺病毒载体。
(2)成体干细胞基因修饰提高存活及植入效率。鞘氨醇激酶(SPK)是一种具有抑制细胞凋亡作用的信号分子,其产物S1P对干细胞具有广泛的调控作用。SPK基因修饰可以明显提高骨髓MSC胞内SPK酶活性并促进细胞的存活和归巢,表明SPK基因修饰是提高MSC应用效率的有效策略。
(3)肝细胞生长因子(HGF)基因修饰干细胞特性及应用。生长因子的基因修饰也是增强干细胞治疗效果的重要措施。肝细胞生长因子(HGF)是一种具有促进肝再生、血管生成和抑制纤维化等多种功能的生长因子。在实验动物模型中,HGF基因修饰的骨髓MSC对心肌缺血、放射性肺损伤、肝脏损伤、股骨头坏死等损伤性疾病具有较好的治疗效果。成体干细胞基因修饰能够提高干细胞对疾病的治疗效果,并在多种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。

2015-01-22 课时:28分钟

间充质干细胞的免疫调解机制及临床应用

间充质干细胞(MSC)具有低免疫原性及向缺血或损伤组织归巢的特征,输入宿主体内后,可归巢于特定部位,在微环境影响下定向分化为内胚层、中胚层以及外胚层3个胚层来源组织的细胞,如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等10余种成熟细胞.因而成为再生医学中器官修复的理想种子细胞。近年来研究发现除多向分化潜能外,MSC还具有较好的免疫调控作用,主要免疫调控机制为1)抑制T细胞增殖,诱导T淋巴细胞亚群由Th1、Tc1向Th2、Tc2极化;2)抑制DC细胞成熟与分化,减少DC细胞IL-12及TNF-α的分泌;3)上调CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞,诱导免疫耐受;4)抑制细胞毒T细胞,避免或逃逸被细胞毒T细胞和NK细胞攻击。基于对其作用机制的明确及体外细胞水平和动物模型水平的研究基础,目前已有较多应用MSC于异基因造血干细胞移植后的移植物抗宿主病(GVHD)的防治;再生障碍性贫血(AA)、系统性红斑狼疮及多发性硬化等自身免疫性疾病的治疗的临床研究。

在GVHD防治方面,迄今为止在Clinical. trial 登记的临床研究有近20项;初步的结果显示了较好的安全性和有效性,可显著降低GVHD发生率,减少移植相关死亡率(TRM),但Katarina Le Blanc于2008年发表在Lancet上的一项多中心研究提示早期预防性输注MSC也可增加白血病复发风险,目前多数研究者倾向于将MSC用于激素耐药或难治性GVHD的治疗,我们采用供者或第三方来源的的骨髓MSC每周一次静脉输注治疗了20例移植后GVHD患者[平均输注量:0.8 (0.23~2.1)×106/kg;平均输注次数3(1-5)次],结果治疗组总体有效率(CR+PR)达70%;且发现MSC对移植后肝脏GVHD及皮肤GVHD疗效更为显著,而并不增加疾病复发风险;另外第三方供者的MSC联合脐血干细胞输注对移植后造血恢复不良也有较大改善。

再生障碍性贫血(AA)是一类T细胞介导的骨髓造血衰竭性疾病,目前临床除部分患者采用骨髓移植或强化免疫抑制治疗外并无更好的方法,我们的研究发现AA患者血浆及外周血CD3+,CD8+细胞内IFN-γ,TNF-α高表达;骨髓液及血清中游离TNFR1、TNFR2等负调控因子水平也较高;AA患者T细胞亚群的异常除CD4+T/CD8+T细胞;Th1/Th2细胞失衡外,还存在CD4+CD25+FoxP3+Treg表达减低;另外也发现DC1与成熟DC1的失衡可能在AA发病环节中具有重要作用。早期的动物模型研究证实了免疫细胞治疗可促进经放射造模的骨髓衰竭小鼠造血恢复,并证实其机制为抑制DC细胞成熟与分化,减少DC细胞IL-12及TNF-α的分泌,体外细胞实验则证实MSC可抑制AA患者外周血T细胞增值;下调AA患者GATA-2、PPARγ表达及BMNC凋亡率;上调AA患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的表达;经总结我们在Clinical trial 登记的关于MSC治疗AA的前瞻性多中心的临床研究,25例的初步结果显示:BMSC输注射治疗AA可上调其Treg水平,与传统IST相比,总有效率更高,安全性好,长期疗效及不同类型AA的疗效差异有待扩大病例数进一步研究。

MSC对其它自身免疫性疾病如多发性硬化也有较好的疗效,小样本的临床研究与传统激素治疗相比,MSC治疗可减少疾病复发,无明显毒副作用。

总之,由于MSC与T、B淋巴细胞、NK细胞、DC细存在交互作用的免疫调控作用,其在白血病移植后GVHD、AA、多发性硬化等自身免疫性疾病方面有较大应用前景,值得进一步深入研究。

2015-01-23 课时:26分钟

细胞治疗肝硬化和肝癌的基础和临床应用研究

钱程指出,细胞生物治疗作为新型治疗手段所取得的疗效已受到人们的重视。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一种具有双向分化潜能并可参与新血管生成和组织的中胚层前提细胞。EPCs能够参与血管损伤修复和具有组织损伤修复功能。

  钱程带领的课题组研究表明,在肝硬化发生过程中,组织损伤释放的趋化因子能够有效募集EPCs进入肝脏。EPCs对多种因素引起的肝损伤和肝硬化具有保护和修复功能。EPCs治疗能显著降低肝硬化的发生。

  对于肝癌的细胞生物治疗,由于肝癌患者体内存在免疫抑制环境,治疗细胞功能的发挥受抑制,治疗效果有限。因此在临床治疗时,需降低肿瘤负荷,采取多次输注的方式进行治疗。为增强免疫细胞的治疗效果,钱程带领的课题组和国内外科学家相继提出免疫细胞——基因疗法,即采取体外基因修饰的方法,向治疗细胞中导入免疫调节因子如IL-12,通过免疫调节因子的作用,改变体内免疫环境,增强治疗细胞的功能和延长作用时间,提高治疗效果。

2015-01-29 课时:19分钟

SynVivo的应用

SynVivo是一款模拟体内血管环境的微流体芯片,可以模拟仓鼠、大鼠和小鼠的不同血管。提供形态和生物学仿真微环境,可以对药物等微粒与细胞的相互作用进行实时观察研究,其中一些特殊芯片可以培养特定组织类型的细胞,如神经元、肝细胞或肿瘤细胞等。 SynVivo在体外条件下,利用微循环网络模拟在体条件下细胞/微粒粘附、细胞-细胞或细胞-微粒相互作用。研究流体和形态对药物研发和细胞研究的影响.。得到剪切力-粘附效应图,分叉与分支粘附效应等。研究人员只需用适当的底物覆盖微芯片的通道(如纤连蛋白),然后在其中培养细胞,就可以建立人工的体内环境。这一系统可通过流动的液体来模拟天然的血液。
SynVivo在细胞行为、药物粒子粘附和吸收机制、药物输送、药物发现、药物毒性分析等领域有广泛应用

2015-01-30 课时:4分钟

Image J 应用实例

来自生物谷的孔静同学为大家带来“Image J 应用”,内容包括:
一,多色荧光图片叠加;
二,免疫组化及荧光强度分析;
三,连续照片合成视频

2015-02-02 课时:4分钟

卫生部第三类医疗技术临床应用能力技术审核

吴苏伟主任主要围绕以下四个部分做了详细介绍:
一、背景介绍
1、第三类医疗技术
2、技术审核机构
3、首批允许临床应用的第三类医疗技术目录
4、技术管理规范
二、技术审核流程
三、申报要点
四、注意事项

2015-02-03 课时:35分钟

干细胞技术与组织工程研究及应用

曹教授首先总结了目前可用的治疗组织或器官缺损的方法:自体移植、同种异体移植和组织代用品。其中,第一种方法最为成熟,但是自体移植面积有限,且对被移植部位会造成损害而限制了其大规模应用;第二种方法由于供体有限,且易产生免疫排斥同样限制了应用;最后一种新兴技术方法虽然不够成熟,但由于其克服了上述前两种方法的缺陷显示了巨大的应用前景。

2015-02-05 课时:27分钟

宫内膜干细胞:特征及应用

宫内膜干细胞是多能干细胞,具有增殖能力强 、不导致染色体变异、不导致肿瘤发生等特征,宫内膜干细胞相对于其他干细胞,有较明显的特点:此类干细胞数量多,它是骨髓干细胞的30倍,因而经血将有可能成为全球最大的干细胞来源;体外增殖能力强:24小时扩增一倍,可增殖390次,传代高达50次;分化潜能性大:能表达Oct-4 、SSEA-4和CD 117等干细胞标志物,与胚胎干细胞和骨髓干细胞相近,表明在再生医学上的巨大潜能;免疫原性低,是一类免疫缺陷细胞,不须经过严格配对使用,异体移植无免疫排斥反应或反应较弱;采集方法简单:给女性提供一种简单、无痛、没有压力的方法掌握自己未来的健康,并能让包括亲属在内的他人的健康多一份保障;经血干细胞收集、分离、储存有知识产权的保护。
鉴于宫内膜干细胞潜能,将来可用于治疗帕金森症的研究,细胞形态学的研究,多巴胺水平的增加和器官移植等的研究,还可用于治疗脑中风的研究和增加宿主细胞的生存率研究。项教授指出宫内膜干细胞在血吸虫肝硬化病和心源性肝硬化病的临床治疗中也表现出良好的效果。

2015-02-05 课时:19分钟