Science子刊：肿瘤无处逃！临床前研究表明三特异性duoCAR-T细胞可有效治疗抗原异质性癌症

2021年4月3日讯/生物谷BIOON/---随着靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）疗法（CAR19 T细胞）和靶向CD22的CAR-T细胞疗法（CAR22 T细胞）的出现，对B细胞白血病和淋巴瘤的治疗有了明显的改善。然而， CAR-T细胞治疗后的复发仍是一个障碍，而且有多达50%的接受CAR19 T细胞治疗的患者在治疗后第一年内复发，这些复发患者的相当一部分人表现出CD19抗原丢失。同样地，CAR22 T细胞治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）后的复发与恶性肿瘤细胞的CD22蛋白下调有关，以至于CAR22 T细胞无法再识别和杀死它们。在先利用CAR19 T细胞治疗再利用CAR22 T细胞治疗的过程中，CD19和CD22肿瘤表面抗原的顺序丢失也在弥漫性大B细胞淋巴瘤中有报道。同样地，在CD20靶向抗体利妥昔单抗（Rituximab）治疗过程中，CD20抗原丢失在非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和滤泡性淋巴瘤中有报道。为了解决肿瘤抗原逃逸的问题，来自美国Lentigen公司的研究人员之前已经开发了一种靶向CD19和CD20抗原的串联双特异性CAR20-19构建体，并在1期临床试验中显示出有前景的疗效和耐受性。

利用多特异性CAR-T细胞靶向肿瘤细胞据推测可减轻肿瘤抗原逃逸，提高治疗效果。此前，Lentigen研究人员已在在人源化小鼠异种移植模型中证实，duoCAR-T细胞（双CAR-T细胞，即表达两个串联在一起的CAR的T细胞）在控制HIV感染方面比monoCAR-T细胞（单CAR-T细胞，即表达单个CAR的T细胞）更有效。

如今，在一项新的研究中，Lentigen研究人员让表达靶向CD19和CD20的串联CAR的慢病毒载体转导原代CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所表达的串联CAR通过P2A自切割肽与靶向CD22抗原的monoCAR操作性连接在一起，据此开发出三特异性duoCAR-T 细胞，并评估了这种三特异性duoCAR-T 细胞解决抗原逃逸问题的能力。相关研究结果近期发表在Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Trispecific CD19-CD20-CD22–targeting duoCAR-T cells eliminate antigen-heterogeneous B cell tumors in preclinical models”。

这些作者构建出4种duoCAR构建体（称为D1、D2、D3和D4），每个构建体的两个开放阅读框都被一个P2A肽隔开，它们在T细胞表面上的表达谱如图1所示。DuoCAR D1由靶向B细胞抗原CD19和CD20的串联单链可变区片段（scFv）结合结构域、来源于CD8的铰链和跨膜结构域、ICOS共刺激结构域、CD3激活结构域以及位于CD3激活结构域之后的第一代靶向CD22的CAR基因、来源于CD8的铰链和跨膜结构域、CD3激活结构域组成。D2与D1相同，只是用OX40结构域代替了ICOS共刺激结构域。D3含有与构建体D2相同的靶向CD19和CD20的串联CAR基因，该串联CAR基因后面是一个靶向CD22的 CAR基因、第二代ICOS共刺激结构域和CD3激活结构域。D4含有靶向CD20和CD19的串联CAR基因和CD27共刺激结构域，还含有靶向CD22的CAR基和ICOS共刺激结构域，此外每个共刺激结构域后面是一个CD3激活结构域。

图1.双顺反子DuoCAR D1、D2、D3和D4设计、表达和表征。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

将每种duoCAR构建体转导原代人T细胞，由此获得duoCAR D1 T细胞、duoCAR D2 T细胞、duoCAR D3 T细胞和duoCAR D4 T细胞，并在体外培养中增殖8-10天。基于四项独立的转导实验，duoCAR D1的平均表达为64%，D2为56%，D3为60%，D4为45%。这些作者能够持续制造duoCAR-T细胞，而且这些duoCAR-T细胞没有任何不希望的自发激活、衰竭或终末分化的证据。

图2.DuoCAR D1、D2、D3和D4在体外对肿瘤细胞具有较强的特异性毒性。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

他们利用肿瘤细胞系Raji（CD19+CD20+CD22+）和REH（CD19+CD20-CD22+）进行体外测试，发现相比于monoCAR-T 细胞，duoCAR T细胞更强效地裂解Raji细胞和REH细胞，但是没有一种duoCAR T细胞裂解靶抗原阴性细胞系293T（CD19-CD20-CD22-），这表明这种肿瘤杀伤作用并不是抗原非依赖性的（图2）。此外，他们还发现这四种duoCAR细胞在外能够特异性表达三种表面抗原（CD19、CD20和CD22）中任何一种组合（比如仅表达其中的一种抗原、仅表达其中的两种抗原和表达这三种表面抗原）的肿瘤细胞（图5）。

图5.CAR-T细胞对抗原工程靶细胞的体外细胞毒性研究。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

他们还收集duoCAR T细胞与Raji细胞系一起在体外培养时的上清液，并测量上清液中duoCAR T细胞分泌的可溶性细胞因子。他们发现duoCAR T细胞产生细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-9，此外在一定程度上还产生IL-4。正如预期的那样，未用携带CAR的慢病毒载体转导的T细胞（下称UTD T细胞）并不产生细胞因子，从而证实这种细胞因子产生依赖于CAR（图3）。

图3.在与CD19+CD20+细胞系Raji共培养时，CD22+CAR-T释放的细胞因子。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

接着，他们在体内测试了duoCAR-T细胞的疗效。为此，他们在Raji NHL肿瘤异种移植小鼠模型和NALM-6 ALL小鼠模型中测试了duoCAR-T细胞，在这两种小鼠模型中，每种模型都呈现三阳性CD19+CD20+CD22+抗原表达表型。在Raji NHL肿瘤异种移植小鼠模型中，给每只小鼠注射的duoCAR-T细胞剂量分为高剂量（5×106）和低剂量（2×106），结果发现在高剂量组中，这四种duoCAR-T细胞在第14天开始显著地和强效地抑制Raji肿瘤生长，而在低剂量组中，这四种duoCAR-T细胞都能控制Raji肿瘤负荷。在NALM-6 ALL小鼠模型中，这四种duoCAR-T细胞介导了显著的肿瘤排斥反应（图4）。

图4.DuoCAR-T细胞根除淋巴瘤和白血病异种移植模型中的B细胞肿瘤。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

此外，为了测试duoCAR-T细胞对抗原丢失的肿瘤细胞突变体的抗肿瘤功能，给NSG小鼠体内植入5×106 Raji细胞（由Raji19KO细胞、Raji20KO细胞、Raji22KO细胞和亲代Raji细胞组成，每种细胞占25%）。这种Raji细胞混合物代表着一种抗原异质性肿瘤，在这种肿瘤中，一些肿瘤细胞在一定程度上丢失了靶抗原的表达，比如Raji19KO细胞不表达CD19，Raji20KO细胞不表达CD20，Raji22KO细胞不表达CD22，而这种靶抗原表达的丢失会阻止相应的CAR-T细胞激活和抗肿瘤免疫。在注射这种Raji细胞混合物7天后，这些小鼠接受5×106个duoCAR D1/D2/D3/D4 T细胞和作为对照的monoCAR-T细胞。在第14天时，他们发现这四种duoCAR T细胞强效地排斥抗原异质性的Raji肿瘤，而且在这项研究结束时，这些小鼠仍然保持病情缓解状态。相反之下，monoCAR-T细胞不能控制对照组小鼠体内的肿瘤负荷（图6）。

图6.在抗原异质性Raji肿瘤模型中，duoCAR在体内的抗肿瘤活性和持久性。图片来自Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401。

此外，他们还发现当结合靶细胞上的表面抗原时，与monoCAR设计相比，duoCAR构建体能够使CD3强健地磷酸化，并激活下游信号传导蛋白Akt和MAPK p38，以及远端信号介质STAT5。此外，这种duoCAR设计保留了同源monoCAR的关键激活特征，而且激活幅度极小下降或没有下降。

总之，这项研究在体外和体内证实了duoCAR-T细胞的高功能性。这种方法广泛解决了抗原异质性的紧迫问题。此外，这些作者发现了一个未预料到的不包括CD28或4-1BB结构域的最佳共刺激结构域的组合，这表明科学家们对与高活性和长期持久性相关的T细胞信号转导的理解仍在继续完善。在CAR-T方法被认为得到真正优化之前，必须考虑到激活（由CD3磷酸化可知）、长期持续性（由Akt激活所示）以及对通常由细胞因子介导的生理信号作出的反应（比如STAT5磷酸化）。此外，从p38和Erk1/2磷酸化来看，duoCAR中一些激活信号的减少表明，最大的初始激活可能与疾病控制不相关。这项研究开发的duoCAR-T细胞方法在当前CAR-T细胞疗法的基础上进行了改进，克服了肿瘤异质性和肿瘤抗原逃逸的临床挑战，同时保较高的抗肿瘤效力和持久性。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：
Dina Schneider et al. Trispecific CD19-CD20-CD22–targeting duoCAR-T cells eliminate antigen-heterogeneous B cell tumors in preclinical models. Science Translational Medicine, 2021, doi:10.1126/scitranslmed.abc6401.