Science论文详解！基于CRISPR/Cas9的单细胞谱系追踪，揭示癌症异种移植物转移的速率、途径和驱动因子

2021年1月25日讯/生物谷BIOON/---当癌症局限于身体的一个部位时，医生通常可以通过手术或其他疗法进行治疗。然而，大部分与癌症有关的死亡，是由于它的转移倾向，发送自己的种子（癌细胞），可能在全身生根。转移的确切时刻转瞬即逝，混杂在肿瘤中发生的数百万次分裂中。美国怀特黑德研究所成员Jonathan Weissman说，“这些事件通常是不可能实时监测的。”

如今，在一项新的研究中，Weissman领导的一个研究团队把CRISPR工具变成了实现这一目标的一种方法。Weissman实验室与加州大学伯克利分校计算机科学家Nir Yosef和加州大学旧金山分校癌症生物学家Trever Bivona合作，以进化生物学家看待物种的方式对待癌细胞，绘制出极其详细的家族树。通过探究这个家族树的分支，他们可以跟踪癌细胞的谱系，以找到单个肿瘤细胞何时变得异常，将其后代扩散到身体的其他部位。相关研究结果于2021年1月21日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Single-cell lineages reveal the rates, routes, and drivers of metastasis in cancer xenografts”。

每种颜色代表身体的不同位置。色彩斑斓的系统发育树显示了高度转移的表型，这表明一个细胞的后代在不同的组织之间转移了很多次。以一种颜色为主的系统发育树主代表着转移性较低的细胞。图片来自Jeffrey Quinn/Whitehead Institute。

Weissman 说，“通过这种方法，你可以问这样的问题：‘这个肿瘤转移的频率有多高？转移的部位来自哪里？它们去了哪里？’通过能够跟踪肿瘤在体内的历史，你可以揭示肿瘤的生物学差异，而这通过常规手段是观察不到的。”

构建便签簿细胞

科学家们过去曾通过比较癌细胞DNA蓝图中的共同突变和其他变异来追踪它们的谱系。然而，这些方法在一定程度上取决于是否有足够多的自然发生的突变或其他标志物来准确显示细胞之间的关系。

这就是Weissman 和论文共同第一作者Jeffrey Quinn（当时是Weissman 实验室博士后研究员）以及论文共同第一作者、Weissman实验室研究生Matthew Jones看到了使用CRISPR技术---特别是Weissman实验室成员Michelle Chan开发的一种追踪胚胎发育的方法---有利于追踪的机会。

这些研究人员决定利用Chan的方法自己添加标志物，而不是简单地希望癌细胞谱系包含足够多的谱系特异性标志物来追踪。Weissman说，“基本上，我们的想法是设计含有基因组DNA便签簿（scratchpad ）的细胞，然后用CRISPR在上面‘书写’。这种在基因组中的‘书写’是以一种可遗传的方式进行的，这意味着细胞的孙后代将在其基因组中记录其亲代细胞和祖代细胞的‘书写’。”

为了构建这些特殊的“便签簿”细胞，Weissman 对人类癌细胞进行了基因改造，增加了一些基因：一个是编码细菌蛋白Cas9的基因，即CRISPR基因组编辑方法中使用的著名“分子剪刀”；另一个是编码发光蛋白的基因用于显微镜观察；还有一些序列将作为CRISPR技术的靶标。

随后，这些研究人员将数千个这些经过基因修饰的人类癌细胞植入小鼠体内，以模拟肺部肿瘤（Bivona开发的模型）。携带人类肺部肿瘤的小鼠通常表现出侵袭性转移，因此他们推断它们将为实时追踪癌症进展提供一个良好的模型。

当这些癌细胞开始分裂时，Cas9在靶位点进行了较小的切割。当它们修复切口时，它插入或删除了一些随机的核苷酸，从而形成了一个独特的称为indel的修复序列。这种切割和修复几乎在每一代中都随机发生，从而构建出细胞分裂图谱，然后Weissman及其团队可以使用他们与Yosef合作构建的特殊计算机模型进行跟踪。

揭开无形的面纱

通过这种方式跟踪细胞，产生了一些有趣的结果。首先，单个肿瘤细胞之间的差异比这些研究人员预期的要大得多。这些研究人员使用的细胞来自于一种成熟的称为A549的人类肺癌细胞系。Weissman说，“你会认为它们会相对均质。但事实上，我们看到了不同肿瘤转移倾向的显著差异---即使是在同一只小鼠身上，也是如此。有些癌细胞的转移率非常低，另一些些癌细胞的转移率非常高。”

为了找出这种异质性的来源，这些研究人员在不同的小鼠中植入了同一个癌细胞的两个克隆。随着细胞的增殖，他们发现，它们的后代以非常相似的速度发生转移。然而，来自同一癌细胞系的不同细胞的后代却并非如此---这个癌细胞系在体外培养了数代后，明显已经进化出不同的转移潜能。

这些研究人员接下来想知道是什么基因导致了来自同一细胞系的不同癌细胞之间的这种差异性。于是他们开始寻找非转移性肿瘤、转移性较弱的肿瘤和转移性较高的肿瘤之间不同表达的基因。

许多基因脱颖而出，其中的一些基因以前就被认为与转移有关--尽管不清楚它们是推动转移的原因还是仅仅是转移的结果。其中的一个基因编码角蛋白17（Keratin 17, KRT17），在低转移性肿瘤中的表达比在高转移性肿瘤中的表达要强烈得多。Weissman说，“当我们敲除或过度表达KRT17时，我们发现这个基因实际上是在控制肿瘤的浸润性。”

能够以这种方式识别转移相关基因，可能有助于人们回答关于肿瘤如何进化和适应的问题。Weissman说，“这是一种全新的方式来看待肿瘤的行为和进化。我们认为它可以应用于癌症生物学中的许多不同问题。”

从哪里来，到哪里去？

Weissman的CRISPR方法还允许这些研究人员更详细地追踪转移细胞在体内的去向，以及何时转移。例如，一个植入的癌细胞的后代分别进行了五次转移，每次都从左肺扩散到其他组织，如右肺和肝脏。其他细胞则转移到不同的区域，然后从那里再次转移。

这些运动可以整齐地映射在系统发育树（即前面提及的家族树）上（如图所示），每种颜色代表身体的不同位置。色彩斑斓的系统发育树显示了高度转移的表型，这表明一个细胞的后代在不同的组织之间转移了很多次。以一种颜色为主的系统发育树主代表着转移性较低的细胞。

以这种方式绘制肿瘤进展图谱使得Weissman和他的团队能够对转移机制进行一些有趣的观察。例如，一些癌细胞克隆以教科书中提到的方式播种，从左肺，即它们开始的地方，前往身体的不同区域。其他的癌细胞克隆更不规则，首先移动到其他组织，然后再从那里转移。

论文共同第一作者Jeffrey Quinn说，一个这样的组织，即位于肺部之间的纵隔淋巴组织（mediastinal lymph tissue），似乎是一种枢纽。他说，“它充当了一个中转站，将癌细胞连接到所有肥沃的土地上，然后它们就可以去定植了。”

在治疗上，发现这样的转移“枢纽”可能非常有用。Weissman说，“如果你把癌症治疗的重点放在这些地方，那么你就可以在第一时间减缓转移或预防转移。”

在未来，Weissman希望不仅仅是简单地观察细胞，而且还要开始预测它们的行为。Weissman说，“这就像牛顿力学一样--如果你知道速度和位置以及作用在一个球上的所有力，你就可以计算出这个球在未来任何时候会去哪里。我们希望对细胞做同样的事情。我们希望从本质上构建一个驱动肿瘤分化的函数，然后能够测量它们在任何特定时间的位置，并预测它们在未来的位置。”

这些研究人员乐观地认为，能够实时追踪单个细胞的家族树将证实在其他环境中也是有用的。论文共同第一作者Matthew Jones说，“我认为，这将为我们所考虑的生物学中可测量的数量打开一个全新的维度。总地来说，这就是这个领域非常酷的地方，我们正在重新定义什么是不可观察到的，什么是可观察到的。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

1.Jeffrey J. Quinn et al. Single-cell lineages reveal the rates, routes, and drivers of metastasis in cancer xenografts. Science, 2021, doi:10.1126/science.abc1944.

2.Catching cancer in the act
https://www.wi.mit.edu/news/catching-cancer-act

3.Using CRISPR technology, team tracks lineage of individual cancer cells as they proliferate and metastasize in real time
https://medicalxpress.com/news/2021-01-crispr-technology-team-tracks-lineage.html

4.New single-cell lineage tracing technique offers detailed insights into drivers of metastasis
https://www.eurekalert.org/pub_releases/2021-01/aaft-nsl011921.php