Nat Chem Biol：使用两种CRISPR酶，无需扩增，就可在20分钟内高灵敏地检测SARS-CoV-2

2021年8月11日讯/生物谷BIOON/---频繁、快速地检测COVID-19对于控制疫情的蔓延至关重要，尤其是在出现新的、更具传播性的SARS-CoV-2病毒变体时。

虽然如今金标准的COVID-19诊断测试使用qRT-PCR---定量逆转录聚合酶链式反应---非常敏感，可以检测到每微升一个RNA拷贝，但它需要专门的设备、几个小时的运行时间和一个集中的实验室设施。因此，测试通常需要至少一到两天的时间。

在一项新的研究中，由美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu领导的一个研究团队开发出一种比qRT-PCR更快速、更容易部署的诊断测试方法。它如今结合了两种不同类型的CRISPR酶，以构建一种可以在不到一小时内检测出少量病毒RNA的测试方法。相关研究结果于2021年8月5日在线发表在Nature Chemical Biology期刊上，论文标题为“Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases”。

虽然这种新技术还没有达到与qRT-PCR的灵敏度---可以检测到每微升液体中仅有的几个病毒拷贝---相媲美的阶段，但它能够检测到的病毒RNA水平---大约每微升液体30个病毒拷贝---足以用于监测人群和限制感染的传播。

Savage说，“鉴于这种测试方法足够方便和快速，你不需要PCR的灵敏度，就能在社区中基本捕捉和诊断COVID-19。我们希望将生物化学尽可能地推进到你可以想象一种非常方便的形式，在一个环境中，你可以每天接受测试，比如说，在上班的入口处。”

几种基于CRISPR的测试方法已经被美国食品药品管理局（FDA）授权紧急使用，但所有这些测试方法都需要一个初始步骤，在这个步骤中，对病毒RNA进行扩增，以便检测到信号，这涉及一种荧光分子在蓝光下发出的光线足够明亮，以便可以观察到。虽然这种初始的扩增步骤将测试的灵敏度提高到与qRT-PCR类似的水平，但它也引入了一些步骤，使测试在实验室外更难进行。

这些作者试图在不牺牲检测的简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。论文第一作者、Doudna实验室研究科学家Tina Liu说，“对于即时测试应用，你希望有一个快速的反应，以便人们能够迅速知道他们是否被感染，例如在你坐飞机或去拜访亲戚之前。”

除了增加了一个步骤之外，初始扩增的另一个缺点是，由于它制造了数十亿份病毒RNA，因此在患者样本中出现交叉污染的机会更大。这些作者开发的这种新技术将这一点扭转过来，转而增强了荧光信号，消除了交叉污染的一个主要来源。这种无扩增的技术，他们称之为快速综合核酸酶串联检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT），可以对许多其他传染病进行快速和廉价的诊断测试。

Liu说，“虽然我们启动这个项目的明确目的是影响COVID-19，但我认为这种特殊的技术可以适用于不仅仅是这种大流行病，因为毕竟CRISPR是可以编程的。因此，你可以给CRISPR酶加载一个靶向流感病毒或HIV病毒或任何类型的RNA病毒的序列，并且该系统有潜力以同样的方式起作用。这篇论文真正确立了这种生物化学是一种更简单的检测RNA的方法，并且有能力在敏感和快速的时间范围内检测该RNA，这可能适合于未来在即时诊断中的应用。”

这些作者目前正在使用FIND-IT构建这样的一种诊断方法，这将包括收集和处理样本的步骤，以及在一个紧凑的微流控设备上运行这种测试方法。

利用串联的Cas蛋白

为了从这种测试方法中移除靶标扩增步骤，这些作者采用了一种称为Cas13的CRISPR酶，首先检测病毒RNA，并使用另一种称为Csm6的Cas蛋白放大荧光信号。

Cas13是一把用于切割RNA的通用剪刀；一旦它结合由向导RNA（gRNA）指定的目标序列，它就会被激活和切割一系列其他的RNA分子。这种靶标触发的切割活性可以被用来将特定RNA序列的检测与荧光报告分子的释放联系起来。然而，就其本身而言，当靶RNA的数量非常少时，Cas13可能需要几个小时才能产生可检测的信号。Liu的新见解是使用Csm6来放大Cas13的效果。Csm6是一种CRISPR酶，能感知小环状RNA的存在，并被激活以切割细胞中一系列RNA分子。

FIND-IT示意图，图片来自Nature Chemical Biology, 2021, doi:10.1038/s41589-021-00842-2。

为了提高Cas13的检测能力，Liu和她的同事们设计了一种经过特殊改造的激活剂分子，当Cas13检测到病毒RNA时，该激活剂分子就会被切割。这种激活剂分子的一个片段可以与Csm6结合并触发Csm6从RNA片段中切割并释放出一种明亮的荧光分子。在正常情况下，这种激活剂分子会迅速被Csm6分解，从而限制了它能产生的荧光信号的数量。Liu和她的同事们设计了一种方法，对这种激活剂进行化学修饰，使其免受降解，并可以对Csm6进行超强激活，以便反复切割和释放与RNA相连接在一起的荧光分子。这导致了比原始激活剂好100倍的灵敏度。

Liu说，“当Cas13被激活时，它切割这种较小的激活剂分子，去除一个保护它的片段。如今它被释放了，它可以激活第二种酶Csm6。因此，Cas13识别的一种靶标不仅仅导致其自身的RNA切割能力被激活；它还导致产生更多的活性酶，然后每个活性酶都可以切割更多的荧光报告分子。”

这些作者还纳入了一种优化的gRNA组合，使Cas13对病毒RNA的识别更加灵敏。当这与Csm6及其激活剂相结合时，他们能够在短短20分钟内检测到每微升低至31个拷贝的SARS-CoV-2 RNA。

这些作者还将从患者样本中提取的RNA加入到一种微流控盒的FIND-IT检测模块中，以了解这种测试方法是否能够适应在便携式设备上运行。通过使用一种带摄像头的小型设备，他们可以检测从患者样本中提取的SARS-CoV-2 RNA，其灵敏度可以捕捉到COVID-19感染的高峰期。

Liu说，“这种串联核酸酶方法--Cas13和Csm6的联合使用--在37℃的单一温度下将所有东西结合到单一反应中，因此它不需要高温加热或多个步骤，而这是其他诊断技术所必需的。我认为这为更快、更简单的测试提供了机会，可以达到与目前其他技术相当的灵敏度，并有可能在未来达到更高的灵敏度。”

这种无扩增的RNA检测方法的开发源自加州大学伯克利分校创新基因组学研究所在COVID-19大流行开始时对COVID-19的诊断和治疗问题进行的研究方向调整。最终，加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目。

Savage说，“当我们开始这项研究时，我们希望开发出与PCR相当的测试方法，但不需要扩增，这将是我们的梦想。从灵敏度的角度来看，我们有大约一万倍的差距。我们已经提高了大约一千倍；我们已经将这种差距降低了大约三个数量级。因此，我们快完成了。去年四月，当我们真正开始规划时，这几乎是不可能达到的。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Tina Y. Liu et al. Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases. Nature Chemical Biology, 2021, doi:10.1038/s41589-021-00842-2.