Cell：第三次进化革命！首次揭示糖基化的RNA无处不在，而且它们定位于细胞表面上

2021年5月20日讯/生物谷BIOON/---核酸的出现和蛋白的出现有时被称为第一次和第二次进化革命，因为它们使我们所知道的生命成为可能。一些专家认为，糖基化---将聚糖（glycan）添加到其他生物聚合物上---应被视为第三次进化革命，因为它使细胞能够从相同的DNA蓝图中构建无数的分子形式。长期以来，人们认为只有蛋白和脂质才会接受这些碳水化合物的修饰。然而，在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学和哈佛大学等研究机构的研究人员发现RNA也可以被糖基化，而且这些被糖包裹的核酸似乎会定位到细胞膜上。这是科学家们有史以来第一次在RNA上观察到这一点。相关研究结果于2021年5月17日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells”。

这项研究真正让人感兴趣的地方在于糖基化的RNA（glycoRNA）似乎存在于细胞的外膜上，在那里，它们可以附着在两种唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素（sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins, Siglecs）上，其中Siglecs是一个与包括系统性红斑狼疮（SLE）在内的多种疾病有关的免疫受体家族。所有这些结果表明glycoRNA可能在免疫信号转导中发挥了作用。

挑战糖生物学主流观点

论文第一作者、哈佛大学和波士顿儿童医院的RNA生物学家Ryan Flynn表示，他在斯坦福大学化学生物学家Carolyn Bertozzi的实验室开展研究工作时，惊奇地发现了glycoRNA。Bertozzi表示，她一开始对此持怀疑态度，但在思考了她自己的假设如何影响了她的观点之后，她就改变了看法。她解释道，“我们把所有这些无意识的偏见带到了每个实验中”，一旦她重新审视自己，她发现没有理由认为glycoRNA不应该存在。

碰巧的是，Flynn在2017年作为博士后加入Bertozzi的实验室时，确实着手颠覆糖基化主流观点，尽管这并不是他所期望的那样。他解释说，起初，他关注的是一种古怪的细胞质蛋白糖基化途径，因为他注意到其中的一个关键酶有一个RNA结合结构域。他推断，如果有一种糖基化酶具有结合RNA的潜力，而且它在RNA通常存在的细胞质中发挥作用，它也可能把糖附着在RNA上。

他说，为了寻找这些结构的存在，“非常重要的是，我可以获得不依赖于高温也不依赖于可能会降解RNA的金属的东西”，而这正是Bertozzi实验室所能提供的。她是生物正交化学领域的先驱，该领域旨在开发化学方法来追踪生物大分子在其天然环境中的情况。她的实验室拥有大量的试剂，可以在不损害其他分子或引发副反应的情况下标记特定种类的聚糖。

Flynn开始在HeLa细胞中加入这些标记聚糖的化合物，然后从这些细胞中分离出RNA，看看在他去除所有蛋白和脂质后是否还有任何聚糖信号。他说，他认为当他标记细胞质糖基化途径中使用的聚糖时，他可能会看到聚糖信号。

然而，几个月的实验未能支持这一假设。相反，一些奇怪的事情不断发生在被认为是阴性对照的细胞上：用ManNAz处理的细胞，其中ManNAz是一种叠氮标记的唾液酸聚糖（sialoglycan）前体，而作为一类聚糖，唾液酸聚糖因其作为分泌蛋白、细胞表面蛋白和脂质的修饰剂而为人所知。一旦这些细胞有机会整入ManNAz，它们就被能在不损害RNA的情况下分解细胞成分的TRIzol裂解，而任何幸存下来的蛋白都被蛋白酶降解。这些作者的想法是，最终不会有叠氮信号，因为唾液酸聚糖附着在内质网和高尔基体的蛋白和脂质上，而RNA不可能在那里。Bertozzi说，“我当时想，标记唾液酸聚糖的试剂最终不可能标记RNA，甚至是glycoRNA”，但是这些实验一直给出阳性信号。

因此，这些作者进一步挖掘。他们发现的glycoRNA不仅包含这个特定的聚糖亚群，而且它们似乎主要由YRNA组成，YRNA是一个高度保守性的小型非编码RNA家族，其细胞功能仍不清楚，尽管以前的研究表明它们可能在肿瘤发生和自身免疫中发挥作用。Bertozzi说，所涉及的聚糖和RNA类型的特异性强烈地表明它们是用一种酶相互连接在一起的。

此外，一旦这些作者开始寻找它们，他们就在许多成熟的细胞系---包括癌症衍生的细胞，如HeLa细胞和T-ALL 4118细胞，以及干细胞衍生的CHO细胞和H9细胞---中发现了这些glycoRNA。他们甚至能够在从接受腹腔注射ManNAz的活体小鼠身上提取的肝细胞和脾细胞中检测到glycoRNA，这表明glycoRNA无处不在。

到2019年，这些作者认为他们有足够的支持性数据来提交他们的发现，所以他们将这些发现以预印本文章的形式发表在预印本服务器bioRxiv上。这在科学界引起了轰动，但由于没有经过同行评审，一些人仍然持怀疑态度。如今，经过更多的实验和严格的审查过程，这些作者表示他们的数据变得更加令人信服。

GlycoRNA修饰细胞

这些作者明显分离出一种共价的RNA-聚糖共轭物。然而，巨大的问题仍然存在，包括这些glycoRNA的作用是什么以及它们如何形成。比如，目前还不清楚RNA和聚糖到底是如何物理连接在一起的，如果没有这些信息，一些科学家不太相信这种结合是通过酶的作用发生的。

这些作者认为，RNA的糖基化方式与蛋白的糖基化方式基本相同，甚至需要一些相同的蛋白。正如那篇预印本文章所指出的那样，当他们抑制参与糖基化的关键酶时，glycoRNA以一种剂量依赖的方式消失了。同样，经基因改造后在蛋白糖基化中出现差错的细胞系产生了非常少的glycoRNA。鉴于多个糖基化步骤只有在检查了正确的蛋白折叠后才能进行，RNA与蛋白通过相同的途径进行糖基化将是很奇怪的。因此，科学家们很难想象糖基化在RNA上到底会如何发生。

虽然2019年的那篇预印本文章提出了许多这样的问题，但是有些问题是这项新研究中提出的新数据所特有的。Flynn解释说，也许这项研究最大的补充是发现了这些glycoRNA停留在细胞的外部。这些作者通过将一些ManNAz标记的HeLa细胞短暂地暴露在一种能够从细胞表面切割唾液酸聚糖的酶中，证实了这一点。如果glycoRNA在外面，它们将被切割下来，剩余下来的glycoRNA总量将下降。而这正是他们所发现的：在与唾液酸酶（sialidase）孵育20分钟后，glycoRNA信号就开始减少，一小时后减少了50%以上。他们认为这意味着细胞的一半以上的glycoRNA停留在它的外膜上。

GlycoRNA、糖脂和糖蛋白是细胞糖衣的一部分。图片来自Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2021.04.023。

这些作者通过用一种与双链RNA结合的抗体标记活细胞，进一步探究了这种细胞外定位的假说。大约五分之一的HeLa细胞培养物的抗体染色呈阳性，并且这种标记对RNase处理敏感，这进一步支持glycoRNA确实存在于细胞外膜上的观点。Flynn说，“这开启了很多想法，针对它们的作用，在功能和机制上有很多可能性。”

其中的一种可能性是glycoRNA参与细胞间的信号转导，特别是在免疫背景下，因为这是膜糖脂和糖蛋白的一个已知功能。Bertozzi已经在研究Siglecs---一组调节免疫反应的糖结合受体---的配体，因此这些作者决定看看它们中是否有任何一种与glycoRNA结合。他们首先用不同的Siglecs处理HeLa细胞，以显示这些受体正常地结合，然后用RNase处理这些细胞。瞧，Siglec-11和Siglec-14的结合急剧下降，这表明它们的配体被RNA切割酶从表面裂解了。

Bertozzi表示，该实验表明glycoRNA是Siglec-11和Siglec-14的配体，如果是这样的话，它们将是第一批被确认的Siglec-11配体。

作为一个受体家族，[Siglecs]有点被忽视，因此，这些glycoRNA能与它们相互作用的事实是非常令人兴奋的。有些人想要看看它们是否与疾病有关，特别是系统性红斑狼疮。

GlycoRNA和疾病？

美国宾夕法尼亚大学RNA生物学家Lan Lin表示，她发现2019年的那篇预印本文章非常有趣，所以她申请并获得了先天性糖基化障碍（Congenital Disorders of Glycosylation, CDG）前沿联盟的资助，以研究glycoRNA在CDG中可能发挥的作用，其中CDG是一组由蛋白糖基化途径发生突变引起的罕见先天性疾病。鉴于RNA糖基化可能与蛋白糖基化有关，她表示，“对[我的同事和我]来说，可以合理地假设......这些患者中的一些人可能在他们的系统中的glycoRNA存在差异”，因此，CDG可以被用来检查glycoRNA的潜在功能。

她说，到目前为止，她的团队还没有在健康对照组和CDG患者的细胞之间检测到任何一致的glycoRNA差异。她说，这可能是因为差异更多的是定性的，而不是定量的，比如糖本身或糖基化的RNA亚群的改变。另外，她指出，这张项新研究中的新数据提供了一种解释：glycoRNA的膜定位并不存在于那篇预印本文章中，所以“也许我们找错地方了”。

也有可能是需要新的方法来检测细胞之间的glycoRNA差异。她指出，这项新研究的一个主要限制是ManNAz标记方法不能轻易应用于保存的人体组织样本或血液样本。

一些科学家指出他们希望看到在原代细胞培养物而不是永生化细胞中在开展更多的研究工作，特别是在白细胞亚型中，在这些细胞中，如果RNA在免疫方面有作用，人们可能会期望存在明显的差异。例如，在患有系统性红斑狼疮的人中，不同的细胞类型是否有更少或更多的glycoRNA。

还有科学家认为glycoRNA在糖生物学领域可能是非常重要的，因为这些glycoRNA可能是一种新的信息读取方式。Lan指出，这些发现对RNA研究人员来说特别有影响，因为它们表明有一种全新的转录后修饰需要调查。Bertozzi表示，鉴于glycoRNA位于糖生物学、免疫学和RNA生物学的交叉点，这一发现将这些不同的领域联系在一起。

这些作者表示，他们希望开始回答一些仍然存在的问题，包括聚糖如何附着在RNA上，以及这种附着如何和在哪里发生。他们说，最令人兴奋的部分将是研究glycoRNA发挥的作用。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Ryan A. Flynn et al. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell, 2021, doi:10.1016/j.cell.2021.04.023.

Newly Discovered Glycosylated RNA Is All Over Cells: Study
https://www.the-scientist.com/news-opinion/newly-discovered-glycosylated-rna-is-all-over-cells-study-68773