Cell子刊解读！开发出新型CRISPR标记技术或能提高利用干细胞培养出模式细胞的准确性！

2020年12月8日 讯 /生物谷BIOON/ --日前，一篇刊登在国际杂志Cell Reports上题为“Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens”的研究报告中，来自杜克大学等机构的科学家们通过掌握基因调节网络的“语言”开发了一种新方法能将干细胞转化成为想要的细胞类型。将干细胞转化成为其它类型的细胞并不是一个新的想法，目前已经存在多种方法，但其所得到的结果仍然有一些值得改进的地方；通常情况下，当在实验室培养过程中，程序化的干细胞并不能正确成熟，因此研究人员就需要寻找用于实验的成体神经细胞来最终得到胚胎神经元，而胚胎神经元无法模拟迟发性的精神疾病和神经退行性疾病。

研究者Josh Black说道，这些细胞乍一看可能是对的，但他们往往缺少一种你所想要的关键细胞属性，利用CRISPR基因编辑技术，我们就能开发出新方法来识别出哪些转录因子（基因火星的主要控制器）能帮助制造好的神经元。这项研究中研究者开发出了能够制造成熟成体神经元的新方法，目前该方法能用于编程任何类型的细胞。CRISPR技术通常用于编辑DNA序列，也就是大家俗称的基因编辑，其中Cas9蛋白能与导向RNA结合并指导其切割特定位点的DNA，进而导致DNA序列的改变，DNA编辑如何已经被广泛用于改变基因的序列，但在基因被关闭的情况下其似乎并不能发挥作用。

一种失活的Cas9蛋白（dCas9）能附着在不能切割的DNA位点上。实际上，如果没有另一种分子连接或招募到它，其就不会发挥任何作用；此前研究人员报道了多种方法将不同的分子结构域吸附到dCas9蛋白上，从而来告诉细胞开启基因或重塑染色质的结构；研究人员非常感兴趣利用开启基因表达的特殊工具将一种细胞类型转化为能创造出更好的疾病模型的另一种细胞类型。

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2016年，研究者Black等人报道了一种方法，其能利用基于CRISPR的基因激活子来开启基因网络的表达，从而将组成结缔组织中最容易获得的细胞类型—成纤维细胞转化成为神经元细胞。本文研究中，研究人员旨在通过靶向作用与神经元分化相关的基因网络，但并未产生具有能制造有效疾病模型所需的所有特性的细胞；然而生成所需细胞的正确基因网络是未知的，而人类基因组中编码的可能性或许有数千种，为此研究人员设计出了一种策略来在单一实验中检测所有的网络。

首先他们多能干细胞开始，这种类型的细胞能在机体中转化成为任何一种细胞，为了利用干细胞制造成熟的神经元细胞，研究人员对干细胞进行工程化修饰，一旦其转变成为神经元就会发出红色的荧光，荧光越亮，这种神经元推动的命运就越强，随后研究人员制造出了一个由数千条导向RNAs组成的集合文库，这些RNAs能够针对人类基因组中所有编码转录因子的基因。研究人员向干细胞中引入了CRISPR基因激活剂和导向RNA文库以便每一种细胞仅能够接收一种单一的导向RNA，从而就能够开启特定对应的转录因子基因靶点，随后研究人员根据细胞变红的程度对其进行分类，并对最红和最不红的细胞中的导向RNAs进行测序，这或许就能告诉他们那些基因在开启后会使得细胞变成更多或更少的神经元细胞。当研究人员对利用导向RNAs工程化的干细胞的基因表达进行分析时，研究结果表明，相应的细胞产生了更具体、更成熟的神经元类型，当同时针对一些基因时，这些基因也会一起发挥作用，此外，研究者在实验室中还揭示了一些拮抗干细胞神经元“承诺”的因素，当他们使用基于CRISPR的抑制剂时，或许就能增强神经元的分化。然而，这些结果都只是测定神经元的标志物，要想知道是否这些工程化的细胞真地能够重现更多成熟神经元细胞的功能，研究人员还需要检测其传输电信号的能力。

于是研究人员开始利用一种名为膜片钳电生理学技术（patch clamp electrophysiology）来测定新生神经元细胞中的电信号，通过利用非常小的习惯在细胞上戳一个洞，研究者就能够观察神经元的内部并分析是否其能够传输被称为动作电位的电信号，如果是这样的话，研究人员就知道神经元细胞已经正常成熟了。实际上，被设计用来激活一对转录因子基因的神经元在功能上或许更加成熟，其能更加频繁地释放出更多动作电位；研究者Dube说道，我非常好奇这些干细胞是如何转化成为神经元的，但看到这些重编程的细胞看起来就像是正常的神经元，我就觉得不可思议。

从干细胞转化为成熟神经元细胞的过程需要7天时间，相比其它需要花费数周或数月的方法相比，这种新技术大大缩短了时间框架，这种更快的时间轴或能帮助加速治疗神经系统疾病的疗法和新型检测技术的开发。制造出更好的细胞或能在很多方面帮助科学家们，诸如阿尔兹海默病等多种疾病通常好发于成年人，而且由于在实验室中很难制造出合适的细胞，研究人员常常对这些疾病难以研究。本文研究中，研究人员所开发出的新方法就能够更好地对这些疾病进行建模，同时还能帮助进行药物筛选等。

更广泛地说，筛选转录因子基因和基因网络的相同方法或能用来改善制造任何细胞类型的方法，这对于再生医学和细胞疗法而言或许是变革性的。比如研究者Gersbach就在今年早些时候报道了一种新方法，其能利用基于CRISPR的基因激活技术将人类干细胞转化为肌肉祖细胞，从而用于再生损伤的骨骼肌组织。本文研究的关键在于开发出了能利用基于CRISPR的DNA靶向作用的强大性和可扩展性，从而将任何功能编程到任何细胞类型中，通过利用基因组中已经编码的基因网络，研究人员对细胞生物学的控制能力或许就能得到极大地提高。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

【1】Joshua B.Black，Sean R.McCutcheon，Shataakshi Dube， et al. Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens，Cell Reports (2020) doi：10.1016/j.celrep.2020.108460

【2】CRISPR tagging improves accuracy of model cells grown from stem cells

by Duke University School of Nursing